IV. Трансдукція інсулінового сигналу
1. Інсуліновий сигнал передається в клітку за допомогою мембранного рецептора інсуліну
Рецептор інсуліну (РІ) є тирозинового протеинкиназу, тобто протеїн, фосфорилюється білки по ОН-групі залишків тирозину. Це глікопротеїн, побудований з двох a-субодиниці (130 кДа) і двох b-субодиниці (95 кДа); перші розташовані цілком поза клітиною, на її поверхні, другі пронизують плазматичну мембрану:
Будова рецептора інсуліну
Центр зв'язування інсуліну утворюють N-кінцеві домени a-субодиниці. Каталітичний Тир-протеінкіназной центр знаходиться на внутрішньоклітинних доменах b-субодиниці. При відсутності інсуліну ІР не проявляє тірозінкіназной активності. Приєднання інсуліну до центру зв'язування на a-субодиниці активує фермент, причому субстратом служить сам цей фермент, тобто відбувається автофосфорилювання: фофоріліруются b-субодиниці РІ за кількома тирозинового залишкам.
Каталітична субодиниця РІ (b-субодиниці), що володіє тирозин-протеінкіназной активністю, містить короткий позаклітинний домен (О-і N-глікозильований), трансмембранний домен (23 залишку) і велику внутрішньоклітинну частину. У цій частині є ряд залишків тирозину, схильних до фосфорилированию-дефосфорілірованіе. У позиції 1030 знаходиться залишок лізину, що входить в каталітичний активний центр - АТФ-зв'язуючий центр. Заміна цього лізину на багато інших амінокислоти (шляхом експериментального мутагенезу) знищує тірозінкіназная активність РІ, але не порушує зв'язування інсуліну. Однак приєднання інсуліну до такого РІ ніякого дії на клітинний метаболізм і проліферацію не робить.
Каскад аутофосфорілірованію РІ залучає 6 або 7 тирозинових залишків, причому головні з них - залишки в позиціях 1158, тисячу сто шістьдесят два і тисяча сто шістьдесят три (кіназного регуляторний домен). При аутофосфорілірованію одна b-ланцюг фосфорилирует іншу b-ланцюг тієї ж молекули РІ. Крім того в b-субодиниці є ряд центрів Сер / Тре-фосфорилювання, роль яких залишається неясною. У деяких дослідженнях виявлено, що Сер / Тре-фосфорилирование знижує спорідненість до інсуліну і тірозінкіназная активність РІ.
Фосфорилювання b-субодиниці в свою чергу призводить до зміни субстратної специфічності ферменту: тепер він здатний фосфорилювати інші внутрішньоклітинні білки - субстрати РІ: білки РІ-С1, Shc і деякі інші. Активація та зміна специфічності обумовлені конформаційними змінами РІ після зв'язування інсуліну і аутофосфорілірованію.
Багато модифікації a-субодиниці в експерименті (наприклад, часткове розщеплення протеазами) теж призводять до появи Тир-протеінкіназной активності. Це дозволяє розглядати a-субодиниці як регуляторну субодиницю ферменту: за відсутності інсуліну ця субодиниця пригнічує конститутивно активну каталітичну субодиницю (тобто b-субодиниці).
Тірозінкіназная рецептори - це сімейство білків, у тому числі кілька класів. РІ відноситься до класу II, для представників якого характерна наявність цистеїн-багатого домену в a -ланцюга, а також гетеротетрамерность з -S-S-зв'язками між протомеров. До цього ж класу належить і рецептор інсуліноподібний фактор росту I (ІФР-I), високо гомологічних рецептору інсуліну. Рецептори класу I - мономери; класів III і IV - теж мономери, містять імуноглобуліноподібна повтори в позаклітинній частині.
Т.ч. РІ - інсулін-яка стимулюється Тирозинкіназа, суворо контрольована складним каскадом аутофосфорілірованію по тирозину (позитивна регуляція) і по серину / треоніну (можливо - негативна регуляція). Тирозинкіназа - обов'язковий посередник всіх (або майже всіх) плейотропних дій інсуліну, оскільки мутації в області зв'язування АТФ призводять до втрати здатності РІ до аутофосфорілірованію і здатності клітини реагувати на інсулін.
Зв'язування інсуліну з рецептором служить також сигналом для початку переміщення комплексу інсулін / РІ з мікроворсинок в ті галузі клітинної поверхні, де немає мікроворсинок. Цей процес теж вимагає ліганд-залежного аутофосфорілірованію b-субодиниці і активації кінази. Потім комплекс інсулін / РІ взаємодіє з клатріна-облямованими ямками і інтерналізуются. Далі РІ або повертається в плазматичну мембрану, або включається в лізосоми і руйнується. У багатьох типах клітин інсулін стимулює ендоцитоз і деградацію РІ. Цей процес можна розглядати як механізм негативної регуляції дії інсуліну: зменшення кількості РІ на мембрані і отже ослаблення сігнлов, ініційованих інсуліном, може бути суттєвим для клітини. Синтез тетрамерной молекули РІ кодується однією мРНК, і в результаті трансляції утворюється одна високомолекулярна пептидная ланцюг. Посттрансляційна добудова починається в ЕПР - гликозилирование, освіту внутріцепочечних і межцепочечних -S-S-зв'язків. Далі в апараті Гольджі відбувається протеолитическая модифікація - розщеплення єдиної пептидного ланцюга, освіту тетрамерной молекули, кінцеві гликозилирование і ацилирование жирними кислотами.
2. Активоване рецептор інсуліну фосфорилирует певні цитоплазматические білки - субстрати рецептора
Відомо кілька субстратів РІ: РІ-C1, РІ-С2, Shc, а також деякі білки сімейства STAT (signal transducer and activator of transcription, переносники сигналу і активатори транскрипції). Вони активують різні сигнальні шляхи. Субстрат 1 рецептора інсуліну (РІ-С1) - головний. Цей цитоплазматический білок фосфорилируется по залишками тирозину негайно після стимуляції інсуліном. Фосфорилювання субстрату РІ веде до плейотропний реакції клітини на інсуліновий сигнал. Від ступеня фосфорилювання субстрату залежить збільшення чи зменшення клітинної відповіді на інсулін, амплітуда змін в клітинах і чутливість до гормону. Миші лабораторної лінії, позбавлені гена РІ-С1, виявляють резистентність до інсуліну і знижену толерантність при навантаженні глюкозою. Це вказує на те, що пошкодження гена РІ-С1 можуть бути причиною ІНЗД.
Пептидная ланцюг РІ-С1 містить кілька понад 1200 амінокислотних залишків, 20 - 22 потенційних центрів фосфорілірірованія по тирозину і близько 40 центрів Сер / Тре-фосфорилювання:
Будова субстрату 1 рецептора інсуліну. Числа - позиції тирозинових залишків; в рамках - фосфоріліруемие тирозинового залишки; стрілки - місця переважного зв'язування білків, що містять SH2-домени
В базальному стані РІ-С1 фосфорильованій по серину (в меншій мірі - по треоніну); після стимуляції інсуліном ступінь фосфорилювання і по тирозину, і по серину істотно збільшується. РІ-С1 є також і субстратом інсуліноподібний фактор росту (ІФР-I), який фосфорилирует його по тих же місцях, що і РІ. Рецептори ряду інших факторів росту (наприклад PDGF, EGF, CSF-1) Не фосфорилируют РІ-С1.
Фосфорилювання РІ-С1 за кількома тирозинового залишкам надає йому здатність з'єднуватися з рядом білків, що містять SH2-домени. До таких білків зокрема відносяться Nck, тірозінфосфатаза syp, p85-субодиниця ФМ-3-кінази, Адапторная білок Grb2, протеїн-тірозінфосфатаза SH-PTP2, фосфолипаза Сg, GAP (активатор малих ГТФ-зв'язуючих білків). В результаті взаємодії РІ-С1 з подібними білками генеруються множинні спадні сигнали.
Нековалентні з'єднання білків відбувається за рахунок взаємодії SH2-доменів з амінокислотними послідовностями РІ-С1, що містять фосфорілірованний тирозинового залишок. При цьому не будь-які білки, що містять домени SH2, приєднуються до РІ-С1: наприклад, не приєднуються фосфолипаза Сg або GAP. Вибірковість асоціації визначається амінокислотною послідовністю в області фосфорилированного залишку тирозину (проте, домени SH2 пов'язують з невеликим спорідненістю і вільний фосфотірозінов). Таким шляхом можуть утворитися багатокомпонентні комплекси білків, що беруть участь в трансдукції сигналу. Цей механізм не є специфічною особливістю інсулінової сигналізації: при трансдукції сигналів, що надходять від рецепторів факторів росту, цитокінів та ін. Теж утворюються комплекси з білками, що містять SH2-домени.
У деяких білках, що містять SH2-домени, а також в цитоскелетних білках знайдені SH3-домени; ці домени можуть взаємодіяти з пролин-багатими послідовностями інших білків.
3. Інсуліновий сигнал активує фосфатидилинозитол-3-киназу
Інсулін за посередництва РІ-С1 активує фосфатидилинозитол-3-киназу (ФМ-3-киназу). ФМ-3-кіназа каталізує фосфорилювання ФМ, ФМ-4-Р і ФМ-4,5-Р2 по позиції 3; утворюються відповідно ФМ-3-Р. ФМ-3,4-Р2 і ФМ-3,4,5-Р3:
Фермент являє собою гетеродімер, що містить регуляторну (Р85) і каталітичну (Р110) субодиниці. У регуляторної субодиниці є два SH2-домену і SH3-домен, тому ФМ-3-кіназа з високою спорідненістю приєднується до РІ-С1. Ізольовані домени SH2, отримані з Р85 (регуляторної субодиниці), інгібують утворення комплексу з цільної ФМ-3-кінази. З цього випливає, що фермент приєднує РІ-С1 своєї регуляторної субодиницею. При утворенні комплексу ФМ-3-кіназа активується.
Активація ФМ-3-кінази є ланкою сигнального шляху, стимулюючого транслокацию ГЛЮТ-4 з цитозолю в плазматичну мембрану, а отже - і трансмембранний перенос глюкози в м'язові і жирові клітини. Інгібітори ФМ-3-кінази пригнічують і базальное, і стимульоване інсуліном споживання глюкози; в останньому випадку відзначено зниження транслокация ГЛЮТ-4 до мембрани. У дослідженнях з культурами м'язових клітин отримані результати, що дозволяють припускати таку ланцюг подій при стимуляції інсуліном споживання глюкози: РІ-С1 ® ФМ-3-кіназа ® ПК-С ® транслокация ГЛЮТ-4. Протеїнкіназа З in vitro прямо активується поліфосфоінозітідамі. Механізм активації in vivo невідомий.
У жирових клітинах активація ФМ-3-кінази інсуліном призводить до пригнічення ліполізу. Лимитирующей стадією ліполізу в адипоцитах є реакція, що каталізується гормончувствітельной липазой, яка активна в фосфорильованій формі (цАМФ-залежне фосфорилювання). При стимуляції інсуліном концентрація цАМФ в адипоцитах знижується в результаті наступного каскаду реакцій: фосфорилируется (і активується) протеинкиназа В (ПК-В), яка фосфорилирует (і теж активує) фосфодіестеразу цАМФ:
При низькій концентрації цАМФ ліпаза знаходиться в нефосфорілірованном неактивному стані. Коротко сигнальний шлях від інсуліну до фофодіестерази можна змалювати таку картину: інсулін / ФМ-3-кіназа /. / ПК-В / фосфодіестерази. Проміжні ланки між ФМ-3-кінази і ПК-В не вивчені.
Багато факторів росту стимулюють ФМ-3-киназу, але не впливають на обмін глюкози. Це вказує на те, що різні сигнальні входи мають специфічні механізми для використання ФМ-3-кіназної системи, щоб генерувати специфічний кінцеву відповідь.
Інсулін і фактори росту, що діють через Тир-кіназного рецептори, активують ФМ-3-кінази класу 1, побудовані з каталітичної субодиниці 110 кДа і адапторной субодиниці Р85. У інсулінзавісимих тканинах знайдені дві форми каталітичної субодиниці - р110a і р110b. Відомі також дві форми адапторной субодиниці, р85a і р85b, з високою гомологією амінокислотноїпослідовності і просторової структури: кожна з них містить два SH-домену, два пролин-багатих домену, SH3-домен і Bcr-гомологічний домен. Крім того, виявлено кілька укорочених форм адапторной субодиниці: вони не містять SH3-домену, Bcr-гомологичного домену та одного з пролин-багатих доменів. В адипоцитах людини екпрессіруется тільки Адапторная субодиниця р85a, в той час як в клітинах скелетних м'язів 7 варіантів: р85a, р85b і п'ять укорочених. Різні варіанти адапторних білків не в однаковій мірі включаються в фосфотірозіновие комплекси при інсулінової стимуляції. Ці результати вказують на можливість розгалуження сигнального шляху внаслідок ізбірателной мобілізації певного варіанту Адапторная білка (або певного набору адапторних білків) в залежності від природи первинного стимулу.
4. Інсулін активує сигнальний шлях Ras
Білки Ras входять в суперсімейство малих ГТФ-зв'язуючих білків. Це невеликі білки (молекулярна маса 21 кДа, близько 190 амінокислотних залишків), що містять на С-кінці ковалентно пов'язаний фарнезільний або геранільний залишок:
За допомогою такого гідрофобного кінця білки Ras (p21ras) прикріплюються до внутрішньої поверхні плазматичної мембрани. Ras залучені в різноманітні клітинні процеси, включаючи везикулярний транспорт, функції шаперонов, проліферацію.
Як і всі ГТФ-зв'язуючі білки, Ras регулюються циклом ГТФ-білок (активна форма) U ГДФ-білок (неактивна форма). У цих перетвореннях беруть участь ще й інші білки: GAP (GTPase activating factor), GEF (GTF exchange factor) і SOS; два останніх білка забезпечують відділення ГДФ від Ras і приєднання ГТФ.
У яка покоїться клітці р21ras знаходиться переважно в неактивній ГДФ-формі. Стимуляція клітини інсуліном (а також іншими факторами росту і митогенами) призводить до швидкого зростання кількості активної ГТФ-форми. Відбувається це в такий спосіб. Невеликий цитозольний білок Grb-2 (growth factor receptor bound protein), що містить SH2- і SH3-домени, може нековалентно приєднуватися до фосфорильованій РІ в області певних фосфотірозінових залишків:
Активація інсуліном сигнального шляху Ras / МАРК. Показані не всі білки, названі в тексті. Просторове розташування білків "грона" відобразити на площині неможливо: наприклад, активна Raf-1-k контактує не тільки з Ras-ГТФ, але і з мембраною, з рецептором інсуліну і з деякими іншими білками.
Цьому взаємодії сприяє один з субстратів РІ, а саме Shc. Далі утворився комплекс взаємодіє з іншим комплексом, що містить білок Ras (р21ras). Білки Grb2 і Shc називають також Адапторная білками, оскільки вони пов'язують тірозінкіназная рецептори (в даному випадку РІ) з білком Ras. У комплекс також включаються білки, що забезпечують обмін ГДФ / ГТФ і активацію Ras (SOS, GAP, GEF, OST). На цитоплазматичної частини рецептора інсуліну утворюється велике гроно взаємодіючих білків. Таким чином інсулін активує білок Ras, і інсуліновий сигнальний шлях з'єднується з сигнальним шляхом Ras.
Активація Ras є кінцевою ланкою трансмембранної передачі сигналу і початковою ланкою цитоплазматических і ядерних сигнальних шляхів. Ці шляхи складають каскад протеінкіназной реакцій за участю протеїнкінази Raf-1, МАПКК (мітогенактівіруемой протеїнкінази киназа) і МАПК (мітогенактівіруемие протеїнкінази). Активоване Ras набуває здатності з'єднуватися з протеїнкіназою Raf-1. Raf-1 знаходиться в цитоплазмі в з'єднанні з деякими білками теплового шоку, і в цьому стані не володіє протеінкіназной активністю; фермент активується в результаті з'єднання з білком Ras. Цей процес складний: для повної активації Raf-1 потрібно його приєднання до плазматичної мембрани, фосфорилювання по тирозинового остакам ферментом саркокіназой (Src), фосфорилювання по серинових і треонінових залишкам специфічної протеїнкіназою С, а також взаємодія з рецептором інсуліну. Таким чином в цей момент гроно білків на рецепторі інсуліну ще більше зростає.
Активована протеинкиназа Raf-1 фосфорилирует (активує) МАПКК, яка фосфорилирует МАПК. Активована МАПК фосфорилирует певні білки цитоплазми (зокрема - протеїн pp90S6, фосфоліпазу А2 і рибосомальної киназу).
Сигнал може передаватися також і в ядро, забезпечуючи регуляцію транскрипції певних генів: фосфорілірованний МАПК фофорілірует (активує) ряд факторів транскрипції.
Шлях Ras активується не тільки інсуліном і його рецептором, а й багатьма іншими гормонами, факторами росту і їх рецепторами. З цими процесами, зокрема, пов'язана клітинна проліферація і трансформація. Однак кінцевий відповідь клітини на різні сигнали буває різним, виявляється специфічним для даного першого вісника сигналу. Це пов'язано, зокрема, з наявністю варіантів білків (сімейства), що беруть участь в трансдукції сигналу.
Активація шляху Ras інсуліном призводить, поряд з іншими відповідями клітини, до зміни обміну глікогену:
Регуляція синтезу глікогену інсуліном через сигнальний шлях Ras. ПФГр-1 - протєїнфосфатаза гранул глікогену; КФ - кіназа глікогенфосфорилази; ГФ - глікогенфосфорилази; ГС - глікогенсінтази. У рамці - процеси, які при стимуляції клітини інсуліном припиняються внаслідок дефосфорилирования кінази глікогенфосфорилази.
Одним з ферментів каскаду протеинкиназ, активуються комплексом Ras, є протеинкиназа рр90S6. Цей фермент каталізує Сер / Тре-фосфорилирование протєїнфосфатаза, пов'язаної з гранулами глікогену (ПФГр-1). Фосфорильована (активна) форма ПФГр-1-Р дефосфорилюється (активує) глікогенсінтази (прискорюється синтез глікогену). ПФГр-1-Р дефосфорилюється також киназу фосфорілази і глікогенфосфорілазу (припиняється мобілізація глікогену). Таким довгим шляхом інсуліновий сигнал доходить до одного з кінцевих, ефекторних ланок.