Скляні та кварцові кювети
Важливою характеристикою кювет є пропускання світлового потоку стінками кювети, це залежить від матеріалу, з якого виготовлена кювету.
Кювети зі звичайного скла не рекомендують використовувати навіть в ближньому ультрафіолеті, тобто при 340 нм через сильне поглинання скла в цій області спектра. Для роботи в далекому ультрафіолеті рекомендується використовувати флуорітовие кювети, які прозорі для довжин хвиль 125 - 200 нм. Кювети зі звичайного боросилікатного скла підходять для вимірювань у видимій та ближній УФ частинах спектра. Для роботи в більш короткохвильовій області (менше 300 нм) потрібні кювети з кварцу.
У клінічній біохімії прийнято використовувати прямокутні кювети з плоскопараллельнимі стінками і довжиною оптичного шляху 1 см. Прямокутні кювети практично не змінюють напрямок світлового потоку і незначні переміщення такої кювети в світловому потоці не призводять до суттєвих помилок вимірювання.
У спектрофотометрах і сучасних фотометрах широко застосовуються прямокутні кювети з полістиролу макротип (розмір 10 × 10 × 45 мм), в яких вимірюється в обсязі близько 1 мл, і полумікрокюветах (рисунок 104) розміром 10 × 4 × 45 мм, обсяг реакційної суміші близько 0,5 мл. У мікрокювет промінь проходить по вузькому каналу шириною до 2 мм на тій самій відстані в 10 мм, як в макрокюветах, тому промінь повинен бути вузьким. Для точної орієнтації кювет потрібні спеціальниедержателі.
Пластмасові кювети мають хорошу прозорість і у видимій, і УФ областях, але використання пластмасових кювет наштовхується на проблеми забезпечення допусків, очищення, стійкості до дії розчинників, температурних деформацій.
Більшість пластмасових кювет розроблено для одноразового використання.
Створено також фотометри, в яких фотометрирование проводитися в круглих пробірках. Фотометрична осередок таких фотометров сконструйована таким чином, що пробірка займає завжди одне і теж положення в світловому потоці (центрируется).
В іншому випадку незначні зміщення пробірки від заданого положення можуть привести до великих помилок, так як пробірка є циліндричною лінзу. Інше джерело помилки - еліптичність (відхилення від циліндричної форми) пробірки. Усунути цю помилку можна тільки експериментальним шляхом. Потрібно нанести маркер на одну якусь сторону пробірки і встановлювати в подальшому пробірку в фотометр тільки в одній і тій же орієнтації. Еліптичність призводить до зміни стандартної оптичної довжини пробірки і це відхилення (систематичну помилку) потрібно визначити за допомогою стандартних розчинів і враховувати в подальшому при обробці результатів. Звичайно, цей метод придатний тільки для ручних технологій роботи на фотометрах.
Крім прямокутних кювет і пробірок в фотометрах з вертикальним фотометрірованія застосовуються групові кювети - 8-ми і 12-ти ямковий стрипи, планшети з 96 лунок і 9-ти ямковий блоки (рисунок 106). Планшети бувають цільними і складальними з 8-12 стрипів.
Лунки в стрипах і планшетах мають циліндричну форму невеликого діаметру, що призводить до виникнення меніска рідини. Увігнутий меніск подібний розсіює лінзі, опуклий - збирає лінзі. Наявність меніска сферичної форми висуває суворі вимоги до позиціонування лунки в оптичному каналі фотометра. Для компенсації впливу меніска дена лунок іноді роблять сферичної форми, а світловий промінь можливо тонше і фокусують його на поверхню меніска на осі симетрії.
Кювети повинні бути чистими і оптично прозорими. Розлучення або наліт на
стінках, очевидно, змінять величину поглинання. Скляні кювети, використовувані в видимому діапазоні, очищаються рясним мити водопровідною і дистильованою водою. Лужні розчини не повинні залишатися в кюветах тривалий час, так як луг повільно розчиняє скло, що призводить до розлучень.
Кювети можуть очищатися в помірному миючому засобі або обполіскувати сконцентрованої сумішшю HC1. вода. етанол (1: 3: 4). Кювети ніколи не потрібно обполіскувати кольоровими очисними розчинами, так як розчини мають тенденцію адсорбироваться на поверхні і змінювати колір скла.
Кювети, використовувані для вимірювань в УФ області спектра повинні оброблятися з особливою ретельністю. Невидимі подряпини, відбитки пальців або залишкові сліди раніше виміряних розчинів можуть значно вплинути на поглинання. Хороший спосіб перевірки кювет полягає в тому, що всі використовувані кювети заповнюються дистильованою водою, потім вимірюється поглинання кожної кювети проти бланка. Ця величина, по суті, повинна бути дорівнює нулю.
В даний час в деяких фотометрах використовуються проточні кювети. У цих кюветах реакційна суміш через помпу подається в вузький канал, в якому проводиться вимір оптичної щільності. Стандартна проточна кювета має внутрішній об'єм (в якому проводиться безпосередньо вимір)
30 мкл. У проточних кюветах подальша проба вимиває з кювети попередню пробу. Для того щоб не було ефекту переносу при послідовному вимірі різних проб (надійно промивалася кювету), рекомендується пропускати через кювету не менше 10 кратного обсягу в порівнянні з вимірювальним обсягом, тобто не менше 300 мкл.
Зменшення обсягу реакційної кювети має обмеження. При ручному дозуванні навіть з використанням автоматизованих піпеток небажано працювати з обсягами менше 8 - 10 мкл, так як при такому дозуванні істотно збільшується помилка, пов'язана з обсягом біопроб. Особливо сильно цей фактор впливає при дозуванні в'язких розчинів. Як правило в клінічній хімії використовуються співвідношення обсяг біопроб / об'єм робочого реактиву в діапазоні 1. 10 - 1. 200. Тому найбільш поширеними є вимірювальні кювети з об'ємом близько 1 мл.
У біохімічних автоаналізаторе використовуються реакційні кювети з малим об'ємом до 100 мкл. При цьому дозування здійснюється з діапазоном в 0,1 мкл. Для цього використовуються спеціальні гамільтоновскіх шприцеві дозатори і стандартна процедура дозування. Крім того, застосовуються схеми дозування з поділом в наконечнику повітряною пробкою обсягів біопроби і робочого реактиву і вимивання з наконечника біопроб додатковим обсягом розчинника.