піч для розплавлення препаратів,
11-клавішні лічильники, посуд.
Фіксація. Після взяття матеріалу для мікроскопічного дослідження його поміщають в фіксуючу рідину. Мета фіксації полягає в затримці змін, що виникають в тканинах, ізольованих від живого організму і збереження тканинних і клітинних структур в стані їх прижиттєвого будови.
З метою рівномірного омивання шматочків тканин фіксатором, ємності струшують з періодом в декілька (1-2) годин. Для рівномірного просочення матеріалу фіксатором шматочки органів беруться розміром 0,5 - 1 см.
В якості фіксатора використовується 10% розчин формаліну, приготований на фізіологічному розчині, так як дистильована вода викликає значне обводнення і набухання тканин. Для гістологічних і гістохімічних досліджень в якості фіксатора використовується рідина Буена. У фиксаторе може зберігатися - від 48 годин до 30 днів.
Промивання і зневоднення матеріалу.
Промиванням забезпечується початкове очищення матеріалу від самого фіксатора і різних опадів, що виникають в період фіксації. Проводиться промивка в проточній водопровідній воді протягом 10 - 20 хвилин.
Для зневоднення використовується набір спиртів (етиловий спирт) підвищується концентрації від 70 до 100%.
Для отримання хороших мікроскопічних препаратів велике значення має поступовість зневоднення, так як при швидкому зневодненні тканини (особливо ті, які мають пухку консистенцію) можуть зморщуватися і деформуватися (Єлісєєв, 1954; 1959).
Використовується така методика зневоднення спиртами:
70% - 2 год. 80% - 12 год. 90% - 2 год. 96% - 1 година. 100% - 1 година.
Періодично набори спиртів оновлюються, так як в процесі роботи відбувається їх обводнення і забруднення речовинами, вилучаються з матеріалу, особливо жиром.
Заливка матеріалу в застигають середовища.
Після зневоднення фрагменти органів ретельно промакают фільтрувальної папером і поміщають в 1% розчин целлоидин.
Розчин готується шляхом розчинення 1 м целлоидин в 100 мл суміші рівних частин спирту і ефіру. У цій концентрації целлоидин легко проникає в глиб об'єкта і повністю просочує його. В середньому, тривалість утримання матеріалу в розчині целлоидин становить 6 діб.
На наступному етапі проводиться очищення матеріалу від целлоидин. Для цього зразки органів і тканин відмивають дві години на хлороформі, потім 2 години в термостаті при температурі 37 градусів в снегоподобной масі, що представляє насичений розчин парафіну в хлороформі. Далі проводиться в термостаті при температурі 56 градусів просочування в чистому парафіні протягом 1 год. потім проби переносяться в чистий парафін - на 1 годину. Після цього шматочки заливаються в суміш 100 р парафіну з 5 р воску і швидко охолоджуються в воді з кубиками льоду для запобігання утворенню повітряних бульбашок в парафінових блоках.
Отримані парафінові блоки наплавляються на дерев'яні кубики, необхідні для закріплення блоків при різанні тканин на мікротому.
Для заливки матеріалу використовується білий парафін, який має точку плавлення не вище 52- 54 ° С. Для більшої пластичності парафіну до нього додається 5% бджолиного воску. З метою витіснення з розплавленого парафіну надлишків газів, його кілька разів кип'ятять на електричній плитці з закритою спіраллю з наступним швидким охолодженням на льодяній бані.
Приготування зрізів проводиться на санному мікротому з використанням мікротомних ножів. Товщина одержуваних зрізів - 1, 2, 3. 4, 5, 6 мкм.
Для видалення складок і расправкі стрічки або серії зрізів їх поміщають на поверхню в широкому посудині (кристалізатор) з водою при температурі 40 ° С. Расправка зрізів проводиться препаровальной голкою. Потім розправлені зрізи поміщаються на спеціально приготовлене предметне скло і висушуються на спеціальному столику з підігрівом до 370 градусів. Скло обезжирюються в суміші спирт-ефір (1: 1).
Для більш міцного приклеювання парафінових зрізів предметні скельця попередньо ретельно змащуються сумішшю білка з гліцерином у співвідношенні 1: 1. Нанесений на предметне скло тонкий шар суміші нагрівають над полум'ям спиртівки для видалення вологи. Надалі ці скла використовують для наклеювання зрізів препарату. Скло підписують тушшю, змішаної з білком (1: 1) і прожарюють.
Перед фарбуванням зрізи, добре висушені і приклеєні до предметних стеклах, звільняють від парафіну. Для цього зрізи поміщають на 30 сек. в ксилол I. потім на 30 сек. в ксилол II. Після розчинення парафіну препарати витримують 1 хв. в 100% спирті, потім 1 хв. в 70% спирті. Після спиртів препарати промиваються дистильованою водою.
Фарбування зрізів проводиться за методом Маллорі (Роськин, 1951).
Зрізи з дистильованої води переносяться в 0,1% розчин кислого фуксину на 3 хв. При цьому зрізи набувають рожеве забарвлення. Наступний етап - 5 хв. в 1% розчині фосфорномолібденовой кислоти. Цей розчин закріплює забарвлення кислим фуксином. Зрізи споліскують в дистильованої воді, потім на 1 хв. занурюють в суміш анілінового синього, оранжевого G і щавлевої кислоти. (Суміш Маллорі) (Роськин, 1951).
Після фарбування зрізи диференціюються 70% спиртом (2-3 сек.) І 96% спиртом (2-3 хв.), Проводяться через ксилол і полягають в канадський бальзам. Готові препарати, які можуть зберігатися безстроково, вивчаються під мікроскопом при збільшенні об'єктивів 8 x. 40 x. 90 x (іммерсія).
Фіксовані препарати зрізів тканин микроскопируются на приладах "Olympus" (Японія) і "Jenamed" (Німеччина).
Вибір збільшення при розгляді об'єктів залежить від конкретних завдань - від 40 х до 1000 х.
• для гонад - діаметр зрілих і незрілих ооцитів, діаметр ядра ооцитів, відстань від оболонки ооцита до ядра як показник стадії зрілості ооцита (Сакун, Буцька. 1963), деформованість ооцитів, стан цитоплазми, стадія зрілості чоловічих статевих продуктів (Турдаков А.Ф. 1972), стан стінок ампул і кровоносних судин;
• для печінки - структура паренхіми і сполучної тканини, діаметр ядер гепатоцитів, стан кровоносних судин, стан цитоплазми гепатоцитів;
• для селезінки - те ж саме, що і для печінки, а також розміри червоно-білої пульпи, наявність клітин крові, скупчення пігментів;
• для нирок - стан епітелію звивистих канальців, стан гемопоетичних, сполучної тканин, боуменовой капсул, скупчення пігментів.
Цитометричних дослідження проводяться за допомогою окуляр-мікрометра з ціною поділки, визначеної для кожного мікроскопа індивідуально