• Моторні білки зберігають активність в клітинних екстрактах. Це дозволяє виділяти їх в очищеному вигляді
• Моторні білки прикріплюються до скла і забезпечують ковзання мікротрубочок по поверхні
• Намистини - кульки, вкриті моторними білками, здатні транспортуватися по микротрубочкам
• Використовуючи мікротрубочки з позначеної полярністю, можна визначити, в якому напрямку рухається по ним мотор
Відкриття і виділення моторних білків мікротрубочок були пов'язані з розробкою нових методів, які дозволили дослідникам вивчати їх рухливість в екстрактах клітин in vitro або використовуючи очищені препарати білкових моторів. До відкриття кінезин привели спостереження над рухомими везикулами в грубому екстракті клітин - по суті нерозбавленою цитоплазмі - приготованому з одного гігантського аксона кальмара.
Аксон є перспективний об'єкт для пошуку таких молекулярних моторів, оскільки по його микротрубочкам здійснюється інтенсивний рух везикул. Гігантський аксон відокремлювали від тіла кальмара, і з нього видавлювали цитоплазму (або аксоплазме, як її вважають за краще називати нейробіологи), яку для спостереження руху поміщали на предметне скло. Шляхом фракціонування аксоплазми і дослідження рухливості кожної фракції Рон Вейл з співр. виділили перший кінезіновий мотор.
На відміну від традиційних біохімічних досліджень. які виконуються в пробірках, рухливість досліджується під мікроскопом, що дозволяє простежити за рухом, яке забезпечується мотором. Яким чином під мікроскопом можна спостерігати активність мотора? Щоб виявити рух, необхідно стежити за об'єктом в часі. При цьому білки повинні бути нативними. При застосуванні електронної мікроскопії це виключається.
Остання вимагає жорсткої хімічної обробки зразків, яка інактивують білки. Світлова мікроскопія не має настільки високою роздільною здатністю як електроннная, але має ту перевагу, що зазвичай вимагає менш жорсткою обробки зразків або взагалі її не вимагає. Тому її можна використовувати для вивчення процесів вимагають активних білків і які тривають кілька хвилин або довше. Однак мікротрубочки занадто малі, щоб пов'язану з ними рухливість можна було спостерігати за допомогою звичайного світлового мікроскопа.
Зображення мікротрубочки, отримане за допомогою DIC-мікроскопії з подальшим комп'ютерним посиленням.
Зображення виглядає зернистим, однак чітко видно положення мікротрубочки і її довжина.
За допомогою цього методу можна вимірювати довжину микротрубочек, спостерігати рухливість і транспортні процеси з їх участю.
Цікаво, що для дослідження рухливості білкових моторів карго не потрібно. Це пояснюється тим, що, на відміну від мікротрубочок, білкові мотори зв'язуються зі скляними поверхнями (предметне і покривне скло мікроскопа). При зв'язуванні зі склом тільки моторів, їх активність дозволяє микротрубочкам переміщатися по поверхні. Відповідні приклади представлені на малюнках нижче.
Тест переміщення микротрубочек був використаний для дослідження біохімічних фракцій, які виходили при очищенні першого кінезин. Цей тест зазвичай застосовується для дослідження моторних білків мікротрубочок. В одній з його модифікацій використовують скляні або латексні намистинки, покриті білковими моторами, і спостерігають їх рух по микротрубочкам.
Така «бусіночная проба» кілька складніша, оскільки за намистинками і мікротрубочками необхідно спостерігати за допомогою світлового мікроскопа. У всіх випадках мікротрубочки спочатку стабілізують, шляхом їх зв'язування з паклітакселом.
Характерна особливість білкових моторів полягає в тому, що вони здатні переміщатися уздовж мікротрубочки тільки в одному напрямку. Для того щоб визначити, чи рухається мотор у напрямку до плюс або мінус-кінця, необхідно висяніть, яким чином визначається полярність мікротрубочки. Один із способів, що дозволяють визначити полярність, спочатку включає складання радіальних структур микротрубочек на ізольованих центросома, а потім їх фіксацію на матеріальному склі. Потім на це скло наносять намистинки і спостерігають їх рух.
При цьому намистинки. покриті білковим мотором, які рухаються до центру структури, рухаються до мінус-кінця, а ті, які рухаються від центру, рухаються до плюс-кінця. Ще один спосіб позначити полярність микротрубочек заснований на більш швидкої полімеризації плюс-кінця. Для виконання тесту спочатку формують короткі мікротрубочки з дуже високим відсотком субодиниць, що містять флуоресціюючий зонд. Ці яскраво світяться мікротрубочки потім використовуються як центри нуклеации довших мікріотрубочек в розчині, що містить набагато нижчий відсоток флуоресціюючого тубуліну.
Молекули тубуліна додаються до обох кінців трубочок-центрів нуклеації, але набагато швидше до плюс-кінця. В результаті утворюється набір мікротрубочок з одним коротким і дуже яскравим ділянкою в середині, і більш тьмяним, але видимими ділянками на кінцях. Ділянка з плюс-кінця гораз довше, ніж з мінус-кінця, що відразу ж дозволяє визначити полярність мікротрубочки. Ці флуоресцирующие мікротрубочки з позначеної полярністю можна використовувати для визначення рухливості з метою визначити напрямок руху. При розшифровці результатів експерименту важливо пам'ятати, що білкові мотори зафіксовані.
При русі мотора в напрямку плюс-кінця микротрубочка буде просуватися вперед своїм мінус-кінцем. Майже всі методи визначення рухливості є варіанти цих тестів. Характер поставлених завдань, деталі експериментальних пристосувань і дозвіл системи детекції можуть відрізнятися, але основний принцип залишається тим же самим.