Розрізняють такі основні методи: мікроскопічний, мікробіологічний, експери-ментальний, імунологічний.
1.Мікроскопіческій - вивчення мікробів в пофарбованому і незабарвленому (нативном) стані за допомогою різних типів мікроскопів. Метод дозволяє визначити форму, розміри, розташування, структурні елементи і відношення до фарбування мікробів. Іноді за характерними морфологічними особливостями можна визначити вид мікроба (грибів, найпростіших, деяких бактерій).
Експериментальний (біологічний) - зараження мікробами лабораторних тварин. Метод дозволяє:
виділити чисту культуру мікробів, погано ростуть на поживних середовищах;
вивчити хвороботворні властивості мікроба;
отримувати імунобіологічні препарати для специфічної профілактики, діагностики та лікування.
4. Імунологічний (в діагностиці інфекцій) - вивчення відповідних специфічних реакцій макроорганізму на контакт з мікробами.
У відповідь на надходження мікробних часток (антигенів, АГ) імунна система організму виробляє специфічні білкові молекули - антитіла (AT), здатні вступати з даними ан-тігеном в специфічну взаємодію з утворення комплексу АГ + АТ. Метод заснований па виявленні таких комплексів. Виділяють 2 різновиди методу: серологічний метод і алергічний метод. Серологічний метод заснований на виявленні AT в крові або інших рідинах за допомогою відомих мікробних АГ (діагностикумів). Алергічний метод заснований на виявленні підвищеної чутливості (алергії) до повторного вступу в організм мікробного алергену (АГ). Наявність імунної відповіді (у вигляді AT або алергії) свідчить про попередню зустріч з цим мікробом: можливо, людина перехворіла відповідної ін-фекции раніше, була вакцинована або хворий в даний час.
Часто за освітою комплексу АГ + АТ з відомими AT визначають вид чистої культури невідомого мікроба, отриманої в ході дослідження мікробіологічними методом (Ідентифіка-кація за антигенною структурою).
Морфологія і фізіологія мікроорганізмів мікроскопічний метод дослідження
• Світловий мікроскоп з иммерсионной системою
Для вивчення мікробів в мікроскопі потрібне збільшення приблизно в 1000 разів. Тому використовується мікроскопи з иммерсионной системою ( "іммерсіей" - занурення) До складу імерсійної системи входить іммерсійний об'єктив (х 90) і іммерсійне масло, яким заповнюють розрив між досліджуваний предметом і передньою лінзою иммерсионного об'єктива. Оскільки по-ники заломлення скла і масла близькі, це дозволяє уникнути втрати світлових променів внаслідок їх відхилення, і, тим самим, створити оптимальну освітленість поля зору. Необ-ходімость в концентрації світлового пучка обумовлена також і надзвичайно малим діаметром передньої лінзи иммерсионного об'єктива. При мікроскопірованіі необхідно пам'ятати, що об'єктиви "сухий системи" не призначені для занурення в масло, яке може привести їх у непридатність. Мікроскопія з иммерсионной системою дозволяє вивчати вбиті мікроби в ок-рашен стані (їх форму, розміри, взаємне розташування, будова бактеріальної кліть-ки) і диференціювати одні мікроби від інших.
Здатність мікробів фарбуватися різними методами називають тинкторіальних властивостями.
У деяких випадках (вивчення морфології грибів, найпростіших, інших щодо круп-них об'єктів в живому незабарвленому стані) використовується світловий мікроскоп із затемненим полем зору (об'єктиви х 40 або х 8) Для мікроскопії готують препарати "розчавлена крапля" або "висяча крапля".
Вивчення морфологічних ознак мікробів (довжина, ширина, форма) нерідко проводять для визначення їх виду. Розміри клітинних мікроорганізмів варіюють від часток мікрометра (мкм, 10 -6 м) до декількох десятків мікрометрів. Дрібні клітини бактерій мають розміри 1-2, великі від 8 до 12 мкм і більше. Для вимірювань використовують окуляр-мікрометр (вбудовану в окуляр прозору лінійку).
• Темнопольний мікроскоп (ультрамікроскоп)
Особливістю цього мікроскопа є наявність конденсора темного поля (параболоїд-конденсатора), який концентрує світловий пучок і направляє його на досліджуваний об'єкт збоку. З огляду на те, що прямі промені відсікаються центральної діафрагмою конденсора, а косі промені, що виходять по периферії діафрагми, не потрапляють в об'єктив, мікроскоп має темне поле зору. При висвітленні косими променями живих і неживих частинок, в т.ч. мікробів, частина від-вираз променів потрапляє в об'єктив; при цьому спостерігається яскраве свічення частинок на темному тлі. Темнопол'ную мікроскопію використовують для вивчення рухливості мікробів, спостереження дуже тонких об'єктів (спірохет) в препараті "роздавлена крапля".
Цей різновид світлового мікроскопа дозволяє вивчати структуру живих нефарбованих мікробів (прозорих об'єктів). При проходженні світла через нефарбовані мікробні клітини, на відміну від забарвлених, амплітуда світлових хвиль не змінюється, а відбувається лише їх зміна по фазі, що ні вловлюється оком людини. Зрушення по фазі відбувається при проходженні участ-ков з більшою оптичною щільністю (рибосоми, нуклеоїд). Спеціальні пристосування: фазовий конденсор і об'єктиви з фазовими кільцями дозволяють перетворити невидимі фазові зміни в видимі амплітудні.
Принцип роботи цього мікроскопа заснований на явищі люмінесценції. Для отримання з-браженія об'єктів їх обробляють флюорохромами, які при збудливу опроміненні ко-ротковолновой частиною спектра світяться квітами з більшою довжиною хвилі (зеленим, помаранчевим і ін.). У люмінесцентному мікроскопі вивчають як живі, так і вбиті мікроби (з "сухий" або иммерсионной системами). Люмінесцентна мікроскопія дозволяє отримати контрастне колір-ве зображення, виявити мала кількість мікробів, вивчити їх структуру і хімічний со-ставши, використовувати метод імунофлюоресценції.
Цей прилад відрізняється від світових мікроскопів значно більшою роздільною спо-можності (близько 0,001 мкм) за рахунок використання замість світла пучка електронів, а замість стек-лянних оптичних - електромагнітних лінз. В електронному мікроскопі вивчають віруси, ультраструктуру убитих макроорганизмов.
Приготування препарату для мікроскопічного дослідження
Забарвлення по Граму.
1 етап - приготування мазка.
Предметне скло обпалюють в полум'ї газового пальника. Восковим олівцем відзначають межі майбутнього мазка у вигляді кола діаметром 1-2 см. І кладуть скло на стіл. Прожарений-ної петлею наносять в середину гуртка невелику краплю стерильного ізотонічного розчину хлориду натрію (їхн). Потім в цю краплю вносять невелику кількість культури бактерій, тща-кові емульгують і розподіляють тонким шаром в межах гуртка. Мазки з бульйонних куль-тур готують без попереднього нанесення їхн.
2 етап - висушування.
Скло залишають на повітрі до зникнення вологи.
3 етап - фіксація.
Фіксацію проводять для того, щоб убити мікроби, прикріпити їх до скла, підвищити їх сприйнятливість до барвників. Для фіксації предметне скло (мазком догори) тричі накла-дивают на полум'я на 2-3 секунди з інтервалом 4-6 секунд. Мазки з гною, крові, мокротиння, набряклої рідини фіксують зануренням в фіксують рідини (ацетон, суміш Никифор-ва). Така фіксація дозволяє уникнути грубих деформацій об'єкта дослідження.
4 етап - забарвлення.
Розрізняють прості і складні (диференційні) способи забарвлення. Прості способи по-зволяют судити про величину, форму, локалізації і взаємне розташування клітин. Складні спо-соби дозволяють встановити структуру мікробів і часто їх неоднакове ставлення до фарбуєте-лям. Прикладом простих способів може служити забарвлення фуксином (1-2 хвилини), метиленовим синім або крісталлвіолетом (3-5 хвилин), а складних - забарвлення по Граму, Романовським-Гімзою, Ціль-Нільсеном.
Диференціює метод Грача
Після забарвлення цим методом одні бактерії, забарвлюються в темно-фіолетовий колір (грампозитивні, Гр +). інші - в бордово-червоний (грамнегативні, Гр). Сутність цього способу забарвлення полягає в тому, що Гр + бактерії міцно фіксують комплекс з генціанвіолета і йоду, що не знебарвлюючись етанолом. Гр-бактерії після знебарвлення дофарбовують фуксином.
Гр + бактерії коки
Гр - бактерії коки