Кріо-електронна мікроскопія: як побачити більше
Провідні світові фахівці поділилися з молодими петербурзькими вченими досвідом в області однією з найбільш передових технологій клітинної та молекулярної біології.
Розповідаючи про ті чи інші відкриття і дослідженнях, ми часто беремо до уваги ті методи і прилади, за допомогою яких вчені отримують результати. Інструментами науки і в XXI столітті можуть бути звичайна лінійка, лупа або калькулятор. Але ніщо не стоїть на місці, і зараз за допомогою ультрасучасних приладів можна побачити і окремі атоми і глибини космосу, які віддалені від нас на мільйони кілометрів. Правда, користуватися такими приладами набагато складніше, ніж лінійкою і лупою.
Поперечний зріз голови Caenorhabditis elegans отриманий з використанням методу кріофіксаціі. Ця свободноживущими нематода довжиною близько 1 мм давно став улюбленим модельним об'єктом - першим багатоклітинних організмом, чий геном був повністю розшифрований
Злиття фагосоми, що містить Mycobacterium tuberculosis (збудник туберкульозу) з лизосомой. Так мікобактерії обманюють імунну систему. (Nicole van der Wel and Peter J. Peters, Netherlands Cancer Institute, Amsterdam.)
Справжній учений весь час чогось навчається. Нещодавно в Ресурсному центрі розвитку молекулярних і клітинних технологій СПбДУ пройшла Школа «Методи кріо-електронної мікроскопії та пробопідготовки». Студенти та наукові співробітники під керівництвом провідних світових фахівців у галузі пробоподготовки вчилися працювати на найскладніших приладах. Звичайно, за кілька днів неможливо освоїти всі методики, а ось зрозуміти, як це працює і які дослідження можна проводити представленими методами, - цілком.
Мембранний транспорт, за дослідження якого присуджена Нобелівська премія з фізіології і медицині в цьому році Ренді Шекману, Джеймсу Ротману і Томасу Зюдофу, в наші дні також досліджується за допомогою методів, про які йде мова.
Перевага методу Токуясу, названого на ім'я вченого, який його розробив - Кіотеру Токуясу (Kiyoteru Tokuyasu), в тому, що досліджувана тканину після обробки і виготовлення найтонших зрізів зберігає свою імуногенність, тобто здатність чужорідного антигену викликати імунну відповідь організму. Цікавлять дослідника біомолекули можна помітити антитілами з наночастинками золота і потім під мікроскопом побачити розподіл мічених молекул.
При роботі на такому мікрорівні, як внутрішню будову клітини, дуже важливо не пошкодити об'єкт, зберегти його первісну структуру. «Класичні методи електронної мікроскопії вимагають використання спеціальних речовин, які фіксують агентів, які зшивають між собою білки. У цьому випадку забезпечується добре зберігання зразка, проте така обробка призводить до ряду артефактів, наприклад, втрати міжклітинних просторів. У зв'язку з цим зростає популярність фіксації за допомогою заморожування об'єкта. При звичайних умовах заморозки вода формує кристали льоду, які ушкоджують зразок. Існує кілька підходів, що дозволяють уникнути кристалізації. Перший підхід - використання речовин, що перешкоджають замерзанню при низьких температурах, наприклад, сахарози, як в методі Токуясу. Другий підхід - використання спеціальних умов: миттєвого охолодження і підвищеного тиску. В такому випадку зразок може бути заморожений в так званому «вітріфіцірованних» стані в аморфному льоду, коли кристалічна решітка льоду не встигає сформуватися і зразок з усіма проходили в ньому процесами виявляється одномоментно зафіксовано. При кріо-умовах з отриманого зразка можна зробити зрізи, можна замінити воду на органічний розчинник. При цьому максимально зберігається як структура зразка, так і його імуногенність.
У разі, якщо необхідно досліджувати окремі білкові комплекси, фаги, віруси і навіть дрібні бактерії, можна заморозити їх цілком на спеціальній сіточці, без необхідності виготовлення зрізів. Це може бути важливо, наприклад, у визначенні механізму проникнення вірусу в клітину і залежності конформації поверхневих білків від таких факторів, як pH ». - роз'яснив деякі тонкощі кріо-електронної мікроскопії директор ресурсного центру кандидат біологічних наук Павло Зикін.
Одним з викладачів Школи стала Галина Безнусенко, співробітник Європейського інституту онкології в Мілані. «Кріосрези дозволяють на ультраструктурному рівні проводити подвійне і потрійне мічення. Тобто щоб охарактеризувати стан білка в клітині, можна одночасно помітити і сам білок, і ті компартменти, між якими він переміщається, наприклад ендоплазматичний ретікулюм і апарат Гольджі. При кімнатній температурі це зробити складно через необхідність сильної хімічної фіксації матеріалу, що зменшує ймовірність розпізнавання цих білків специфічним антитілом. Зараз такі дослідження дуже затребувані, про що свідчить і присуджена в цьому році Нобелівська премія з фізіології і медицині як раз за вивчення внутрішньоклітинного транспорту. Розуміння механізмів внутрішньоклітинного транспорту необхідно для вивчення будь-якого процесу, що відбувається в організмі, уявлення як саме діють ті чи інші лікарські препарати і чому виникають захворювання, пов'язані з обміном речовин, - розповіла Галина про те, чому кріомікроскопіческіе методи так важливі для медиків і біологів, - наприклад, є таке важке захворювання - муковісцидоз. В результаті мутації білок, який бере участь в транспорті іонів хлору через мембрану клітини, не виходить з ендоплазматичного ретікулюм, що в підсумку призводить до порушення роботи цілого ряду органів. Є й інші захворювання, в основі яких лежить порушення внутрішньоклітинного транспорту. Тому так важливо володіти самими передовими методиками, що дозволяють вивчати всі ці процеси ».
Оснащення ресурсного центру Галина Безнусенко оцінила дуже високо. Але зазначила і ряд недоліків - дуже щільне розміщення обладнання, брак робочих поверхонь для підготовчої роботи. При роботі з такими тонкими у всіх сенсах матеріями мікроклімат, циркуляція повітря, наявність вільних столів для роботи, є вкрай важливими. Якщо потоки повітря спрямовані не так як потрібно, то дуже складно отримати хороший зріз.
В роботі Школи взяв участь і Гельмут Гнегі (Helmut Gnaegi) - легенда ультратоміі. Свого часу, ще в 1970-і роки, він розробив систему заточки алмазних ножів, які дозволяють отримувати серійні зрізи товщиною всього кілька десятків нанометрів. Гнегі показав, як слід поводитися з алмазними ножами і як отримувати з їх допомогою серійні зрізи.
На світлині:
3. Поперечний зріз голови Caenorhabditis elegans отриманий з використанням методу кріофіксаціі. Ця свободноживущими нематода довжиною близько 1 мм давно став улюбленим модельним об'єктом - першим багатоклітинних організмом, чий геном був повністю розшифрований, на C. elegans були проведені дослідження зеленого флуоресцентного білка, а примітивне пристрій хробака (доросла особина складається з всього лише 952 клітин) стала прообразом для моделювання першого віртуального організму (Courtesy T. Muller-Reichert and Kent McDonald)