Існує два підходи до клонування ДНК. Перший підхід передбачає використання бактеріальних або дріжджових клітин для розмноження введеної в них чужорідної ДНК. Другий спосіб є амплификацию ДНК in vitro.
Клонування ДНК in vivo
Використовуючи мікроорганізми, можна створювати два типи бібліотек ДНК: геномної і клонову.
Геномна бібліотека. Якщо геном будь-якого організму розрізати, вставити в плазмідні або вірусні вектора і ввести в клітину, то в такому вигляді його можна зберегти. При розрізуванні плазмидной або фагової ДНК ймовірність випадання цілих і незмінених шматків генома досить висока.
Такий спосіб отримання геномної бібліотеки отримав назву «метод дробовика», так як геном в даному випадку представлений окремими фрагментами.
Принципи створення плазмідних та вірусних векторів загальні, тому розглянемо їх на прикладі плазмідних. Слід зазначити, що з вірусних ДНК краще використовувати ДНК фагів, так як вони мають велику ємність і дозволяють вставляти більші шматки генома.
Очищені кільцеві молекули ДНК обробляють рестриктазой, отримуючи лінійну ДНК. Клітинну ДНК обробляють тієї ж рестриктазой, додають до плазмидной, додають лігази. Таким чином отримують рекомбинантную плазмидную ДНК, яку вводять в бактеріальні або дріжджові клітини. Плазмида реплицируется з утворенням багатьох копій. Багато плазміди несуть ген стійкості до антибіотиків, і якщо в рекомбінантної плазміди є такий ген, то клітини легко виявляти, вирощуючи на середовищі з антибіотиком.
Кожна така колонія являє собою клон або потомство однієї клітини. Плазміди однієї колонії містять клон геномної ДНК, а сукупність плазмід можна назвати бібліотекою геномної ДНК. Недолік такого методу в тому, що фрагменти ДНК утворюються у величезній кількості. Розрізання геномної ДНК визначається випадком, тому лише частина фрагментів містять повноцінні гени. Деякі фрагменти можуть містити тільки частина гена або ж Інтрони послідовності.
Бібліотека кДНК. Створення кДНК починається з синтезу на матриці РНК за допомогою зворотної транскриптази комплементарної нитки ДНК. Потім створюють лужні умови, руйнують ланцюг РНК на нуклеотиди, після чого за допомогою ДНК-полімерази синтезують комплементарних ланцюг ДНК. При цьому утворюється фрагмент ДНК з тупими кінцями. Таку ДНК вбудовують в плазміди і вводять в клітини бактерій. При ампліфікації плазміди утворюється клон комплементарної копії ДНК.
Переваги клоновій ДНК перед клонами геномної ДНК в тому, що кодує білок нуклеотидних послідовність гена нічим не переривається.
Гени еукаріот містять інтрони, які повинні вилучатися з транскріптной РНК перед перетворенням її в матричну, після чого слід сплайсинг. Бактеріальні клітини не можуть здійснювати таку модифікацію РНК, що утворилася шляхом транскрипції гена еукаріотичної клітини. Тому якщо переслідують отримання білка шляхом експресії клонованого гена, то краще використовувати банк кДНК, отриманої на основі матричної РНК.
Геномні бібліотеки, клонування ДНК in vivo
Після того, як ДНК зшита в пробірці, її необхідно розмножити, тобто клонувати. Мета: отримати численні копії бажаних генів. Для клонування невеликих фрагментів ДНК використовують плазміди або фагів ДНК, для великих - косміди і штучні хромосоми.
Існує два підходи до клонування ДНК:
1) використання бактеріальних або дріжджових клітин для розмноження введеної в них чужорідної ДНК.
2) ампліфікація ДНК in vitro.
Використовуючи мікроорганізми, можна створювати два типи бібліотек ДНК: геномної і клонову.
Геномна бібліотека - це колекція клонів ДНК, що включає всі фрагменти, що входять в геном даного виду. Т. е. Банк генів ще можна назвати набором клонованих фрагментів геному. Якщо геном будь-якого організму розрізати, вставити в плазмідні або вірусні вектора і ввести в клітину, то в такому вигляді його можна зберегти. При розрізуванні плазмидной або фагової ДНК ймовірність випадання цілих і незмінених шматків генома досить висока.
Такий спосіб отримання геномної бібліотеки отримав назву «метод дробовика», так як геном в даному випадку представлений окремими фрагментами.
Принципи створення плазмідних та вірусних векторів загальні, тому розглянемо їх на прикладі плазмідних. З вірусних ДНК краще використовувати ДНК фагів, так як вони мають велику ємність і дозволяють вставляти більші шматки генома.
Для створення банку генів необхідно:
1) виділення всієї геномної ДНК
2) фрагментація ДНК рестріктазамі або ультразвуком
3) Очищені кільцеві молекули ДНК обробляють тієї ж рестриктазой, отримуючи лінійну ДНК. Клітинну ДНК додають до плазмидной в присутності лигаз. Таким чином отримують рекомбинантную плазмидную ДНК
4) рекДНК вводять в бактеріальні або дріжджові клітини, де плазмида реплицируется з утворенням багатьох копій.
5) Клонування бактерій: кожна виникла колонія клітин представляє собою клон або потомство однієї клітини. Плазміди однієї колонії містять клон геномної ДНК, а сукупність плазмід утворює бібліотеку геномної ДНК.
Недолік. фрагменти ДНК утворюються у величезній кількості. Розрізання геномної ДНК визначається випадком, тому лише частина фрагментів містять повноцінні гени. Деякі фрагменти можуть містити тільки частина гена або ж Інтрони послідовності.
Гідність: бібліотека генів може зберігатися і використовуватися необмежено довго.
-джерело матеріалу для вивчення структури, функції і регуляції індивідуальних генів, структури і функції білків
-збереження генофонду зникаючих видів
Аналогічні колекції, отримані з індивідуальних хромосом або їх частин, називаються хромосомними бібліотеками.
Клонування ДНК. Етапи клонування ДНК. Рестрикційні ферменти. Рестріктази. Ендонуклеази.
Клонування ДНК in vivo включає 6 етапів:
1) отримання фрагментів ДНК, в тому числі генів або їх частин за допомогою ферментів рестрикції;
2) рекомбінація фрагментів,
3) вставка фрагмента ДНК в вектор;
4) трансформація за допомогою вектора організму хазяїна;
5) скринінг на рекомбінантний вектор
6) відбір цікавлять дослідника клонів.
Деякі рестріктази, а також послідовності нуклеотидів, які вони розпізнають, і сайти рестрикції в цих послідовностях
Рестрикційні ферменти. Рестріктази. Ендонуклеази.
У кожній хромосомі людини є тільки одна безперервна нитка ДНК. Вона складно упакована для того, щоб поміститися в хромосомі. Маніпулювати з молекулою ДНК такої довжини практично неможливо.
Тому відкриття в 70-х роках XX ст. особливих бактеріальних ферментів. розрізають ДНК на окремі фрагменти, було дуже до речі. Ферменти були названі рестріктазамі або ендонуклеаза.
У бактерій ці ферменти служать для захисту від проникнення в клітину чужорідної ДНК. Зазвичай рестріктази розпізнають так звані паліндромний послідовності нуклеотидів, що спостерігаються в двох нитках ДНК і складаються з 4-6 нуклеотидів.
Приклади кількох рестриктаз показані в таблиці.
Геномні бібліотеки, клонування ДНК in vivo.
Після того, як ДНК зшита в пробірці, її потрібно розмножити, тобто клонувати. Мета: отримати численні копії бажаних генів. Для клонування маленьких фрагментів ДНК вживають плазміди або фагів ДНК, для великих - косміди і штучні хромосоми.
Існує два підходи до клонування ДНК:
1) впровадження бактеріальних або дріжджових клітин для розмноження введеної в їх чужорідної ДНК.
2) ампліфікація ДНК in vitro.
Використовуючи мікроорганізми, можна створювати два типи бібліотек ДНК: геномної і клонову.
Геномна бібліотека - це колекція клонів ДНК, що включає всі шматки, що входять в геном даного виду. Т. е. Банк генів ще можна назвати набором клонованих фрагментів геному. Якщо геном якого-небудь організму розрізати, увіткнути в плазмідні або вірусні вектора і ввести в клітинку, то в такому вигляді його можна зберегти. При розрізуванні плазмидной або фагової ДНК можливість випадання цілих і незмінених шматків генома досить висока.
Такий метод отримання геномної бібліотеки отримав назву «метод дробовика», тому що геном в цьому випадку представлений окремими шматками.
Принципи створення плазмідних та вірусних векторів загальні, тому розглянемо їх на прикладі плазмідних. З вірусних ДНК краще використовувати ДНК фагів, тому що вони мають велику ємність і дозволяють вставляти більш великі шматочки генома.
Для створення банку генів потрібно:
1) виділення всієї геномної ДНК
2) фрагментація ДНК рестріктазамі або ультразвуком
3) Очищені кільцеві молекули ДНК обробляють тієї ж рестриктазой, отримуючи лінійну ДНК. Клітинну ДНК додають до плазмидной в присутності лигаз. Таким чином отримують рекомбинантную плазмидную ДНК
4) рекДНК вводять в бактеріальні або дріжджові клітини, де плазмида реплицируется з утворенням багатьох копій.
5) Клонування мікробів: будь-яка з'явилася колонія клітин представляє собою клон або потомство однієї клітини. Плазміди однієї колонії містять клон геномної ДНК, а сукупність плазмід утворює бібліотеку геномної ДНК.
Недолік: шматки ДНК утворюються в необмеженій кількості. Розрізання геномної ДНК визначається випадком, тому тільки частина фрагментів містять справжні гени. Деякі шматки можуть містити тільки частина гена або ж Інтрони послідовності.
Гідність: бібліотека генів може зберігатися і використовуватися необмежено довго.
-джерело матеріалу для дослідження структури, функції і регуляції особистих генів, структури і функції білків
-збереження генофонду зникаючих видів
Подібні колекції, придбані за рахунок власних хромосом або їх частин, іменуються хромосомними бібліотеками.
Можливо Вам будуть цікаві роботи схожі на: Геномні бібліотеки, клонування ДНК in vivo.
Open Source Content Management
Пишемо і вирішуємо по Мікробіології будь-які теми і питання! Виконання в найкоротші терміни за приємними цінами! Заповніть форму нижче, і отримаєте відповідь протягом 15 хвилин.
Клонування генів- це процедура, що включає виділення і ампліфікацію окремих генів в реципієнтних клітинах, про- або еукаріотичних. З інформаційної РНК, виділеної з однотипних клітин організму, знімають ДНК-копії. які потім вводять в реціпіентние клітини, і амплифицируют. Клонування ДНК in vivo включає 4 етапів:
4) трансформація за допомогою вектора організму хазяїна;
5) скринінг на рекомбінантний вектор
6) відбір цікавлять дослідника клонів.
Реціпіентние клітини - клітини, вибрані для клонування гена, можуть бути як про-, так і еукаріотичних.
мРНК виділяють з клітин або тканин, в яких експресується шуканий ген.
Синтез ДНК - копій здійснюється ферментом РНК-залежною ДНК-полімеразою. щоб цей
фермент почав працювати, потрібно коротка одноцепочечная ДНК-запал; для цієї мети, як правило, використовують oligo. Приманки ДНК мимовільно утворює дволанцюжкові комплекс з відрізком poly.
Деполімерізацию вихідної РНК-ланцюжка здійснюють шляхом лужного гідролізу. ланцюги ДНК
стійкі до обробки лугом, а РНК повністю деполімеризується. Отримана в результаті ДНК є одноцепочечной.
Двухцепочечную кДНК отримують шляхом добудовування оц-кДНК до двухцепочечной форми, виконуваного ферментом ДНК-полімеразою I. Таку кДНК можна вбудовувати в вектор.
Існує два основних типи векторів: бактеріальні плазміди і бактеріофаги.
Плазміди - це зустрічаються в клітинах позахромосомних елементи, що представляють собою замкнуті кільцеві молекули дц-ДНК. Щоб включити кДНК в плазміду, замкнуте кільце плазміди треба «розімкнути». Для цього плазміди піддають дії рестриктаз.
Рестріктаза - розрізає дц-ДНК за певними нуклеотидних послідовностей, званим ділянками рестрикції.
Зшивання - процедура, в ході якої чужорідна ДНК вбудовується між - це процедура, необхідність застосування якої обумовлена тим, що в початковому препараті кДНК представлено багато різних мРНК і лише частина плазмід несе потрібний нам ген.
Ампліфікація здійснюється завдяки тому, що в одній бактеріальної клітці може синтезуватися багато копій, що цікавить нас плазміди, а також за рахунок отримання великої кількості клітин з такими плазмидами. Після виділення і очищення плазміди обробляють відповідної рестриктазой, яка вирізає вбудовані в них копії шуканого гена. Ампліфікований таким чином ген можна використовувати для подальших експериментів в галузі генної інженерії.
Джерела: www.biotechnolog.ru, studopedia.ru, dommedika.com, reftrend.ru, biologymic.ru