У порівнянні з попередньою грою, бойова система не зазнала серйозних змін. За словами розробників, динаміка бою стала більш активною і наступальної. Тепер заохочується швидке настання; контратаки стали менш ефективними. Система поведінки неігрових персонажів стала агресивною, гравця атакують відразу кілька супротивників. Збільшилася кількість зброї, з'явилася можливість використовувати стаціонарні гармати в деяких ігрових ситуаціях. Крім того, серйозно переглянута роль коня, на якій тепер можна пересуватися і в межах міста. Кінь бере участь в деяких елементах паркуру.
В процесі виконання завдань Еціо зустрічає і взаємодіє з різними історичними персонажами, такими як Леонардо да Вінчі, Нікколо Макіавеллі, Катерина Сфорца; представники роду Борджіа є основними противниками гри. Сюжет гри в цілому чітко вписана в хронологічні рамки.
бойова система
Під час бою гравець може виконувати різні фізичні і психологічні атаки, що завдають різний шкоди і дають різні ефекти впливу на супротивників.
В агресивному стані: натискання клавіші голови дозволяє подражнити противника, спровокувавши його атаку; натискання клавіші руки зі зброєю дозволяє провести силову атаку, натискання кілька разів поспіль дозволяє провести комбінацію; натискання клавіші вільної руки дозволяє захопити противника щоб потім: атакувати головою, рукою без зброї або ногою, провести критичну атаку зброєю або відпустити; натискання клавіші ніг дозволяє вдарити супротивника ногою в пах, зменшивши рівень захисту супротивника.
У захисному стані: натискання клавіші голови дозволяє подражнити противника, спровокувавши його атаку (полегшує роззброєння); натискання клавіші руки зі зброєю точно в момент удару супротивника дозволяє провести контратаку (або обеззброїти противника якщо гравець бореться врукопашну, зброя ворога залишається у гравця); натискання клавіші вільної руки дозволяє вивільнитися з захоплення противника; натискання клавіші ніг дозволяє швидко ухилитися від атаки противника.
- Звичайні солдати. Озброєні як правило одноручним зброєю (мечі, булави, молоти). Слабкі, перемагають чисельністю. Атаки наносять відносно малий шкоди, легко блокуються. Солдата дуже просто контратакувати або роззброїти, захист пробивається після кількох звичайних силових атак. Після знищення кількох солдатів інші можуть розбігтися.
- Офіцери. Додатково навчені солдати, озброєні переважно одноручним зброєю (мечі, булави, молоти). Легко контратаку, але важко роззброюються. Вивільняються з захоплення Еціо через деякий час. Можуть атакувати з коня, в цьому випадку для знищення противника доводиться спочатку збивати ворога з коня.
- Спритники. Легкі одиниці, озброєні короткими мечами (ножами, кинджалами). Часто ухиляються від атак Еціо в бою, цей прийом використовується замість блоку. Легко контратаку і обеззброює. Єдиний противник, здатний наздогнати тікає гравця і вдарити ножем по спині, при цьому ассасін різко втрачає швидкість.
- Пройди. Одиниці ворога, озброєні списами або алебардами. Використовуючи свою зброю, можуть перевіряти стоги сіна на наявність в них ассасинов, тобто можуть знайти сховався в стозі сіна гравця. Атаки завдають великої шкоди, пробивають будь-який блок, контратакувати можна тільки спареними прихованими клинками. Блокують захоплення, але легко обеззброює. Варто відзначити, що в руках Еціо забране у противника піку є не менш небезпечною зброєю, здатним також легко пробивати захист ворогів і наносити критичні удари, однак при контратаці піку залишається в противника.